وبلاگ دنا ژن تجهـیز

ایمونوبلاتینگ

جداسازی و تشخیص پروتئین -

تشخیص اختصاصی پروتئین ­ها در غشا

تشخیص یا رنگ­ آمیزی اختصاصی باندهای پروتئینی در غشا، بر پایه واکنش آنها با لیگاندهای اختصاصی صورت می­ گیرد. برای انجام این کار مولکول­های لیگاند را به طور مستقیم (اولیه) و یا غیر­مستقیم (ثانویه) با مواد رادیواکتیو، فلورسانس، مواد رنگی یا
آنزیم­ها نشان دار می­کنند و با کمک آنها به تشخیص اختصاصی پروتئین ­ها می­ پردازند. آنتی­ بادی­ها از پر استفاده­ ترین لیگاندهای اختصاصی هستند که به اهداف مختلف تشخیص اختصاصی پروتئین­ ها می ­پردازند. اساس روش ایمونوبلاتینگ که اهمیت آن بر محققین علوم زیستی آشکار است، موید چنین ادعایی است.

تکنیک وسترن ­بلاتینگ

این روش که به ایمونوبلات نیز معروف است بر پایه واکنش اولیه آنتی­ بادی-آنتی­ ژن می ­باشد. در این روش پس از بلاتینگ پروتئین­ ها، ابتدا مناطق آزاد غشا مسدود می ­شود (مرحله بلوکه کردن). سپس شرایط واکنش­ آنتی ­بادی (برای مثال سرم بیمار) با باندهای پروتئینی فراهم می­ گردد و به دنبال آن، با استفاده از ماکرومولکول­ های نشان­ دار (برای مثال آنتی­ بادی ضد ایمونوگلوبولین انسان که به آنزیم متصل است) نتیجه واکنش اولیه معلوم می ­گردد. امروزه وسترن­ بلاتینگ را به طور گسترده در تشخیص طبی و تحقیقات بکار می ­برند. اگرچه انجام این روش تابع یک سری اصول کلی است، با این حال شرایط و جزئیات آن وابسته به هدف آزمایش است.

مرحله مسدود­سازی

غشاهای مورد استفاده در بلاتینگ ظرفیت زیادی برای گرفتن پروتئین ­ها دارند (برای مثال 100 میکروگرم در هر سانتی ­متر مربع از غشای نیتروسلولز) دارند. این خصوصیت اگرچه در جای خود بسیار مطلوب است ولی با اتصال غیر اختصاصی پروتئین­ های نشان­ دار در مراحل بعدی آزمایش به بروز اختلال در تشخیص منجر می ­شود. از این رو باید مناطق آزاد غشا قبل از مراحل تشخیص مسدود گردد. بهترین راه مسدود­کردن این مناطق آزاد استفاده از پروتئین ­هایی است که خود با مواد نشان­ دار (مثل آنتی­ بادی) واکنش نمی ­دهد. کم هزینه بودن و سهولت تهیه از معیارهای اصلی انتخاب پروتئین مسدود کننده است. در جدول زیر نام و غلظت کاری تعدادی از پروتئین ­های مسدود­کننده آمده است. دترجنت­ ها نیز می­توانند از اتصال پروتئین ­ها به غشا جلوگیری کنند.توین-20 معمول­ترین دترجنت مورد استفاده در این کار است. باید این نکته را توجه کرد که توین -20 در غلظت­های بالا (بیش از نیم درصد) در پاره­ای موارد از اتصال لیگاند به پروتئین نیز جلوگیری می ­کند.

undefined

تشخیص با آنتی ­بادی

پس از بلاتینگ پروتئین ­ها و بلوکه کردن غشا، مرحله تشخیص اختصاصی را می ­توان انجام داد. همان­گونه که قبلا نیز گفته شد ایمونوبلاتینگ در بسیاری از موارد به هدف تشخیص طبی است. در این موارد باندهای انتقال یافته شامل همه یا بخشی ازپروتئین­ های پیکره میکروب (باکتری، ویروس یا قارچ) است که وجود یا عدم وجود آنتی­ بادی ضد سرم آنها در سرم انسان یا حیوان بررسی
می­ گردد. شناسایی با استفاده از آنتی­ بادی ­ها مانند تکنیک الایزا به دو روش صورت می­ گیرد: مستقیم و غیر مستقیم. در تکنیک مستقیم آنتی ­بادی اولیه که جهت تشخیص آنتی ­ژن مورد استفاده قرار می ­گیرد، با استفاده از یک آنزیم و یا رنگ فلوئورسنت نشان­ دار شده است. اما در تکنیک غیرمستقیم، ابتدا یک آنتی ­بادی اولیه به منظور اتصال به آنتی ­ژن افزوده می ­شود. سپس آنتی­ بادی ثانویه که به صورت نشان ­دار شده است، افزوده می­ شود. مولکول بیوتین جهت اتصال استفاده می ­شود و پروب­های فلوئورسنتی مانندفلوئورسئین و یا رودآمین و کانژوگه ­های آنزیمی مانند HRP یا آلکالین فسفاتاز برای شناسایی و تولید سیگنال مورد استفاده
قرار می ­گیرند. شکل زیر اصول کلی این دو نوع تکنیک ایمونوبلاتینگ را نشان می ­دهد.

undefined

شکل 8. روش­های مختلف شناسایی با استفاده از آنتی ­بادی. در قسمت A به صورت مستقیم پروتئین
هدف تشخیص داده می ­شود. در قسمت B به صورت غیر مستقیم
مولکول هدف شناسایی می ­شود.

مواد

1- بافر تریس نمکی با PH 7.5 (TBS). این بافر شامل تریس 20 میلی­ مولار و کلرید­سدیم 15/0مولار است.

2- بافر تریس نمکی حاوی توین 05/0 درصد (TBS-T). به هر لیتر از بافر تریس نمکی 5/0 میلی­ لیتر توین- 20
اضافه شود.

3- آنتی ­بادی اولیه (سرم بیمار یا حیوان ایمن شده). در صورت لزوم با TBS-T رقیق می ­گردد.

4- آنتی­ بادی ثانویه . این آنتی ­بادی ضد بخش ثابت آنتی­ بادی اول است و با آنزیم (پراکسیداز) کونژوگه شده است. رقت مورد نیاز از این آنتی­ بادی در TBS-T تهیه می ­شود.

5- محلول سوبسترای آنزیم پراکسیداز شامل دی آمینو بنزیدین 5/0 میلی­ گرم در میلی­ لیتر و پراکسید هیدروژن 1/0 درصد در TBS
است.

undefined

خرید وسترن بلات

روش آزمایش

1- پس از مرحله مسدودسازی، غشا را 3 بار، هربار 5 دقیقه در TBS-Tبشویید. سپس 1-2 ساعت در آنتی ­بادی اول قرار دهید.

2- غشا را 4 بار هر بار 5 دقیقه در TBS-T بشویید. سپس 1-2 ساعت در آنتی ­بادی ثانویه (آنتی بادی کانژوگه با پراکسیداز) قرار
دهید.

3- غشا را 4 بار هر بار 5 دقیقه در TBS-T بشویید. سپس آن را در معرض مقدار کافی از محلول سوبسترا قرار دهید. ظهور باندها
معمولا 5-15 دقیقه طول می­ کشد. پس از ظهور باندها غشا را در آب مقطر زیاد بشویید. غشا را خشک کرده، در محل تاریک قرار دهید.

**توجه شود که دی آمینوبنزیدین یک ماده بسیار سمی است. از تماس با آن خودداری کنید و در استفاده از آن دقت نمایید.

undefined

نکات مهم تکنیک وسترن ­بلات

1- اگر می­ خواهید تعداد زیادی از نمونه های سرم را بررسی کنید. برای صرفه­ جویی در زمان و مواد می ­توانید غشای نیتروسلولز یا PVDF را به صورت نوارهای طولی به عرض 5/0 سانتی متر ببرید و هر نواری را برای بررسی یک نمونه سرم در لوله آزمایش جداگانه ­ای قرار دهید. برای انجام چنین کاری باید در هنگام الکتروفورز، نمونه­ گذاری در تمام عرض ژل متراکم­ کننده صورت گیرد. بدان معنی که ژل متراکم کننده بدون قرار دادن شانه منعقد می­ شود و در سرتاسر سطح آن نمونه گذاری صورت می­ گیرد. نتیجه الکتروفورز در چنین حالتی وجود باندهای پیوسته پروتئین در تمام عرض ژل می ­باشد.

2- تیتر آنتی­ بادی ­های کانژوگه به عواملی همچون خلوص آنتی­ بادی و آنزیم، روش کانژوگه نمودن و خالص­ سازی و غلظت کانژوگه بستگی دارد. آنتی­ بادی کانژوگه را معمولا 1000-10000 بار رقیق می ­کنند و مورد استفاده قرار می ­دهند. رقت مناسب رقتی است که کنترل مثبت را به وضوح مشخص می ­سازد و حداقل واکنش با زمینه غشا داشته باشد.

3- پراکسیداز پر استفاده­ ترین آنزیم در تهیه کانژوگه آنزیمی است. آلکالین فسفاتاز، گلوکز اکسیداز، اوره آز و پنیسیلیناز از دیگر آنزیم­ هایی هستند که با این هدف بکار می ­روند.