وبلاگ دنا ژن تجهـیز

اصول اولیه طراحی پرایمر

تانک الکتروفورز افقی - hot and cool block - پاور - رنگ dna - ترانسلومیناتور safe - ترانسلومیناتور UV - الکتروفورز افقی - ژل داکیومنت - الکتروفورز عمودی - ژل داک -

پرایمر چیست؟

هیچ DNA پلی­ مرازی قادر به ساختن DNA نیست و همه DNA پلی­مرازها به یک انتهای OH ‘3 نیاز دارند تا بتوانند تکثیر را از روی DNA الگو انجام دهند. به همین دلیل برای تکثیر DNA چه در درون سلول و چه در محیط in vitro نیاز به پرایمر (primer است. در واقع پرایمر توالی کوتاهی از جنس DNA است که با ایجاد یک انتهای OH ‘3 جایگاهی برای فعالیت آنزیم DNA پلی­مراز ایجاد می­کند تا بتواند از رشته الگو سنتز را ادامه دهد. برای تکثیر یک قطعه نیاز به دو پرایمر است که Forward و Reverse نام دارند و با حروف اختصاری F و R نشان داده می‌شوند. اتصال پرایمرها به مولکول الگو بر پایه پیوندهای هیدروژنی استوار است. DNA دو رشته­ایی است و ژن روی یکی از دو رشته قرار دارد. رشته ­ایی که توالی ژن روی آن قرار دارد رشته sense و رشته مقابل آن anti-sense نامیده می­شود. پرایمر Forward برای رشته sense طراحی می­شود. در مقابل، برای سنتز رشته Anti-sense پرایمر Reverse طراحی می­شود. در واقع جهت انجام فرایند تکثیر DNA در دستگاه ترموسایکلر لازم است طراحی پرایمر به خوبی صورت گرفته باشد.

اهداف طراحی پرایمر

1- محدود کردن تکثیر: برای اینکه یک قطعه خاصی از ژنوم را تکثیر کنیم با توجه به توالی DNA الگو پرایمر طراحی کرده و محل دقیق تکثیر را مشخص می­کنیم. مثلا زمانی که هدف تکثیر یک ژن خاص است باید ابتدا و انتهای ژن را بدانیم و از قسمت ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود تا بتوان با استفاده از PCR این ژن را تکثیر کرد و آن را در موجود دیگری کلون کرد.

2- گاهی هدف اثبات وجود یا عدم وجود یک ژن در ارگانیسم است. برای این هدف نیازی نیست که حتما از ابتدا و انتهای ژن طراحی پرایمر انجام شود. می­توان از قسمت­های مختلف ژن پرایمری با کارایی و اختصاصیت بالا طراحی کرد که بسته به طول ژن می­توان از وسط یا قسمت­های دیگر ژن طراحی را انجام داد. ولی در مورد قبل که در بالا ذکر گردید حتما باید از ابتدا و انتهای ژن طراحی انجام شود.

3- پرایمرها برای نقشه یابی ژنوم نیز کاربرد دارند. برای نقشه یابی ژنوم از پرایمرهای تصادفی استفاده می ­شود.

ویژگی های پرایمر

پرایمرهای طراحی شده باید دو ویژگی اصلی و مهم را دارا باشند. کارایی پرایمر یا Efficiency پرایمر یک ویژگی است که نشان می­ده یک پرایمر تا چه حد در اتصال به ناحیه هدف و تکثیر قطعه مورد نظر و ایجاد محصول نهایی موفق بوده است. هر چه کارایی پرایمر بالاتر باشد، باند قوی­تری در ژل الکتروفورز مشاهده خواهد شد.

ویژگی دوم اختصاصیت یا Specificity است که به این معنی است که پرایمر تنها به توالی مورد نظر متصل می­شود و نه هیچ جای دیگری از DNA الگو. بنابراین برای پرایمرهای با اختصاصیت بالا، در الکتروفورز تنها یک باند مشاهده می­شود. برای حفظ این دو ویژگی در طراحی پرایمر باید نکاتی را در حین طراحی رعایت کرد این نکات شامل: طول پرایمر ، محتوای GC، GC Clamp، دمای Tm، دمای اتصال پرایمر به رشته الگو و طول قطعه تکثیری است که در ادامه توضیح داده خواهند شد.