وبلاگ دنا ژن تجهـیز
مهمترین موارد در طراحی پرایمر
تانک الکتروفورز افقی - تانک الکتروفورز عمودی - real time pcr - gel documentation - منبع تغذیه - ترانسلومیناتور UV - ترانسلومیناتور - geldoc - الکتروفورز افقی - منبع تغذیه الکتروفورز - ریل تایم - ژل داک -
1- طول پرایمر
به منظور تکثیر توالی DNA مد نظر محقق در دستگاه ترموسایکلر (دستگاه PCR) لازم است که طول بهینه ای از پرایمر طراحی گردد. طول پرا یمر فاکتوری است که بر اختصاصی بودن پرایمر تاثیر زیادی دارد. بطور کلی DNA از 4 نوع باز تشکیل شده است که طبق قانون احتمالات، احتمال حضور هر کدام از این نوکلئوتیدها برابر یک چهارم است. اگر توالی پرایمر مورد نظر از 10 نوکلئوتید تشکیل شده باشد احتمال وجود چنین توالی روی DNA الگو برابر با یک چهارم به توان 10 است. این بدین معناست که از هر یک میلیون باز، یک توالی مشابه توالی 10تایی پرایمر ما وجود دارد. ژنوم E. Coli حدود 6/4 میلیارد باز تشکیل شده است، پس احتمال وجود پرایمر 10 جفت بازی ما در این ژنوم برابر 6/4 است. به عبارت دیگر 6/4 بار احتمال دارد که پرایمر ما روی ژنوم تکرار شود. اگر طول پرایمر 20 نوکلئوتید شود این پرایمر از هر 50 میلیارد باز میتواند جایگاه خود را پیدا کند. در نتیجه با افزایش طول پرایمر اختصاصیت پرایمر بیشتر میشود. اختصاصیت پرایمر به عوامل دیگری نیز بستگی دارد که در ادامه به آن اشاره خواهد شد.
طول مناسب پرایمر برای ژنهای کاربردی bp 24 -18 است و در این بازه، افزایش هر نوکلئوتید، موجب تقویت ۴ برابری اختصاصیت پرایمر میشود. کاهش طول این رشتهها به شدت بر توانایی اتصال اختصاصی آنها اثرگذار خواهد بود، به طوریکه پرایمرهایی با طول کمتر از bp 15، عملا به هر نقطه از ژنوم متصل میشوند. در شرایط خاص پرایمر میتواند bp 45 – 40 طول داشته باشد. اما باید همواره به این نکته توجه داشته باشید که افزایش طول پرایمر، موجب بیشتر شدن دمای مرحله annealing و زمان آن خواهد شد و علاوه بر این، احتمال تشکیل ساختارهای ثانویه و پرایمر دایمرها را افزایش خواهد داد.
2- درصد GC
درصد GC در طول توالی پرایمر (GC Content)، درصد فراوانی نسبی نوکلئوتیدهای G و C را نشان میدهد که مقدار بهینه این پارامتر 55 – 45% است.
ولی محدوده رایج استفاده از این پارامتر بین 60 – 40% است. هرگز مجاز نیستیم این پارامتر را 80% یا 20% داشته باشیم زیرا دمای annealing مستقیما تحت تاثیر درصد GC است. برای طراحی پرایمر با نرم افزار، باید یک maximum و minimum تعیین شود. که مطابق آنچه در بالا گفته شد تعیین میشود. اگر درصد GC بیشتر از 60 باشد احتمالا پرایمر زمان جدا شدن از رشته الگو با مشکل مواجه میشود. اگر مقدار این پاراکتر از 40 کمتر باشد احتمالا پرایمر نتواند بخوبی به رشته الگو متصل شود.
3- GC Clamp
نکته دیگری در در زمان طراحی پرایمر باید به آن توجه داشت پارامتر GC Clamp است که باید در انتهای ′3 پرایمر رعایت شود. Clamp به معنی گیره است. توصیه میشود که در 5 نوکلئوتید آخر به سمت ′3، یک یا دو نوکلئوتید را گوانین یا سیتوزین انتخاب کرد (شکل 1). سمت ′3 پرایمر سمتی است که Taq پلیمراز متصل میشود و هر چه اتصال سمت ′3 پرایمر محکمتر باشد DNA پلیمراز شانس بیشتری برای اتصال و شروع واکنش دارد. این پارامتر کارایی واکنش PCR را افزایش میدهد. نکته مهم دیگری که باید مد نظر قرار داد این است که تعداد G و C در 5 نوکلئوتید آخر سمت ′3 نباید بیشتر از دو عدد شود. زیرا زمینه را برای ایجاد
مشکلاتی مانند تشکیل دیمرهای پایدار در سر ′3 فراهم خواهد کرد.
شکل 1: گیره GC
4- دمای ذوب پرایمر
مهمترین نکته در طراحی پرایمر دقت به دمای Tm است که مخفف Theorical Melting point می باشد دمای ذوب پرایمر دمایی است که در آن دما P از دو رشته ای ها به صورت تک رشته ایی در آمده اند. این دما به اختصار Tm نامیده میشود که توسط نرم افزار محاسبه میگردد.
سوال اینجاست که چه عواملی روی دمای Tm موثر هستند و ما چگونه میتوانیم دمای Tm را دقیق محاسبه کنیم. اولین عاملی که روی دمای Tm تاثیر دارد GC content است که در بالا به آن اشاره شد. سیتوزین و گوانین پیوند هیدروژنی سه گانه باهم برقرار میکنند اما آدنین و تیمین پیوند هیدروژنی دوگانه تشکیل میدهند. هر چه درصد GC در پرایمر بیشتر باشد پرایمر با قدرت بیشتری به رشته الگو متصل میشود و انرژی بیشتری برای جدا کردن پرایمر نیاز است. انرژی بیشتر یعنی دمای بیشتر و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر میرود.
مورد بعدی که روی Tm پرایمر موثر است طول پرایمر است. هر چه پرایمر طولانی تر باشد میزان پایداری پیوند پرایمر با رشته الگو بیشتر میشود. پس دمای بالاتری برای جدا کردن آن نیاز است و در نتیجه دمای Tm پرایمر بالاتر میرود.
مورد آخری که روی دمای Tm تاثیر گذار است قدرت یونی بافر است. میدانیم که رشته DNA غنی از بار منفی است که توسط فسفات حمل میشود. دو بار همنام یکدیگر را دفع میکنند پس سوال اینجاست که چرا دو رشته DNA همدیگر را دفع نمیکنند و در سلول بسیار پایدار کنار همدیگر قرار میگیرند. در سلول پروتئینهای هیستون وجود دارند که DNA را به دور خود میپیچند. هیستون ها بار مثبت خیلی زیادی دارند که باعث میشود بار منفی DNA خنثی شود و پایداری DNA در سلول بالا رود. اما در واکنش PCR هیستونها وجود ندارند. پس به جای هیستونها، یونهای مثبت را وارد واکنش PCR میکنند. این یونهای مثبت میتوانند از بار منفی DNA کم کنند و در نتیجه پایداری اتصال دو رشته را بالا ببرند. وقتی پایداری اتصال دو رشته بیشتر میشود دمای بالاتری برای جدا کردن دو رشه نیاز است در نتیجه دمای Tm پرایمرها هم بالاتر خواهد بود.
برای درک بیشتر قدرت یونی بافر به مثال زیر توجه کنید. فرض کنید دو محلول داریم که همه شرایط آنها یکسان است اما در محلول شماره 1 غلظت یون سدیم mM 100 و در محلول شماره 2 غلظت یون سدیم mM 50 است. قدرت یونی در محلولی که mM Na 100 وجود دارد بیشتر است. در نتیجه DNA در این محلول پایدار تر است. پس انرژی بیشتری برای اینکه پرایمر یا دو رشته DNA از هم جدا شوند نیاز است. در نتیجه Tm در محلول شماره 1 بیشتر است.
فرمولهای زیادی برای محاسبه Tmارائه شده است که در اینجا چندتا از مهمترین آنها اشاره خواهد شد. اولین فرمول مربوط به مارمر و دوتی (Marmer and Doty) است. یک فرمول سنتی برای محاسبه Tm است. در این فرمول به ازای هر نوکلئوتید گوانین و سیتوزین ˚C 4 و به ازای هر نوکلئوتید آدنین و تیمین ˚C 2 برای Tm پرایمر در نظر گرفته میشود که میتوان با یک جمع جبری ساده مقدار آن را محاسبه کرد.

مثال: توالی پرایمر 5′-CAATCGTACGGATCTAAG-3′ را در نظر بگیرید با توجه به فرمول بالا به صورت زیر محاسبه میشود:
Tm = 2(10) 4(8) = 52˚C
در این فرمول هیچ کدام از عوامل طول پرایمر و قدرت یونی در این فرمول دیده نمیشود. به همین دلیل این فرمول خیلی دقیق نیست. توصیه میشود از این فرمول برای پرایمرهایی با طول بیشتر از bp 14 استفاده نشود.
فرمول دیگر، معادله Wallace است که در این معادله علاوه بر نوع نوکلئوتیدها طول توالی هم برای محاسبه Tmدر نظر گرفته میشود.

اگر Tmهمان پرایمر قبلی با فرمول بالا محاسبه شود مقدار ˚C 76/45 بدست میآید. Tmمحاسبه شده در این روش با مقدار قبلی متفاوت است. قطعا با در نظر گرفتن طول پرایمر، این Tmبه میزان واقعی تر نزدیک خواهد بود. اما ایرادی که در این فرمول وجود دارد این است که مثل فرمول قبلی عوامل دیگر موثر بر Tmدر این فرمول محاسبه نشده است. به همین دلیل فرمول Howlley برای محاسبه دمای Tmمعرفی شد.

در این معادله نه تنها تعداد و نوع نوکلئوتیدها برای محاسبه در نظر گرفته میشود، بلکه قدرت یونی بافر نیز در این معادله گنجانده شده است. پس مقدار نمکی که در بافر وجود دارد را میتوان لحاظ کرد. فرض کنید غلظت یون سدیم M 05/0 است. بر این اساس مقدار Tmمحاسبه شده ˚C 57/51 بدست میآید.
برای تخمین Tm در نرم افزارهای جدید برای پرایمرهای بلندتر، از تئوری ترمودینامیک نزدیکترین همسایه (Nearest Neighbor Thermodynamic Theory) استفاده میشود که پیچیدهتر از فرمولهای بالاست و با استفاده از نرمافزارهای طراحی پرایمر، محاسبه میشود. این فرمول دقیقترین فرمول برای محاسبه Tm است. بررسی دانشمندان نشان داد که یکی از عوامل موثر بر دمای لازم برای جدا کردن دو نوکلئوتید از هم، نوع نوکلئوتیدهای همسایه است. میزان انرژی جدا شدن دو نوکلئوتید را در حالتهای مختلفی از نوکلئوتیدهای همسایه محاسبه کردند و جمع جبری این حالتها را بدست آوردند. عوامل دیگر مثل قدرت یونی مقدار پرایمر در محلول، مقدار منیزیم موجود در واکنش و ... در محاسبات لحاظ کردند. این فرمول یک Tm دقیق از پرایمرها را ارائه میدهد. اگر با نرم افزارطراحی پرایمر Oligo 7 این Tm محاسبه شود مقدار ˚C 79/50 بدست میآید که بازهم با مقادیر محاسبه شده قبلی متفاوت است.
شواهد حاکی از آن است که معمولا، پرایمرهایی با Tm بین ˚C 52 تا 62 ، نتایج بهتری را در PCR نشان میدهند. دمای Tm نباید بیشتر از ˚C 65 باشد. دمای Tm از طول پرایمر و ترکیب بازی تبعیت میکند. هر چه درصد GC بیشتر باشد Tm هم بیشتر میشود. نکته بسیار مهم این است که اختلاف Tm دو پرایمر نباید بیشتر از ˚C 3 – 2 باشد.
5- دمای اتصال پرایمر به الگو
دمای اتصال پرایمر به الگو (Primer Annealing Temperature)که به اختصار Ta نامیده میشود و با Tm ارتباط دارد. اگر دمای Ta بیش از حد بالا باشد منجر به ایجاد محصول ضعیف در PCR میشود که بدان معناست که این پرایمرها ناکارآمد هستند. اگر دمای Ta بیش از حد پایین باشد باعث تولید محصولات غیر اختصاصی میشود. دمای Ta از فرمول زیر بدست میآید:

در این فرمول Tm پرایمر: دمای ذوب ناپایدارترین دوپلکس پرایمر- الگو و Tm محصول: دمای ذوب محصول PCR میباشد. همانطور که از این فرمول پیداست، دمای annealing، همواره پایینتر از دمای ذوب خواهد بود. در آزمایشگاه، معمولا دمای annealing، ˚C ۲ تا ۴، کمتر از دمای Tm در نظر گرفته میشود.
6- طول قطعه تکثیری
با طراحی یک جفت پرایمر forward و reverse اندازه قطعه تکثیری تعیین میشود. که بطور کلی طول قطعه تکثیری بین bp 1000 – 300 است. بهتر است که طول قطعه تکثیری از kb 3 بیشتر نباشد. پرایمرهایی که برای Real Time طراحی میشوند بهتر است طولی بین bp 150 – 50 تکثیر کنند. از پرایمرهایی که طول قطعه تکثیری آنها بیشتر از bp 400 است اجتناب شود.