مواردی که در هنگام طراحی پرایمر باید از آنه ا اجتناب کرد در ادامه توضیح داده خواهند شد. عدم رعایت این موارد کارایی و اختصاصیت پرایمر طراحی شده را بشدت کاهش می­ دهند. این موارد شامل وجود ساختارهای ثانویه، توالی­ های تکراری و وجود تکرارهای چندتایی از یک نوکلئوتید است.

شرکت دنا ژن تولید کننده انواع تجهیزات مولکولی از جمله ژل داکیومنت ، الکتروفورز افقی و الکتروفورز عمودی می باشد.

در این وبلاگ قرار است شرکت دنا ژن به صورت مر تب کلیه تکنیک های مولکولی و ترابلشوتینگ آنها را توضیح دهد.

1- ساختارهای ثانویه (Secondary Structures)

ساختارهای ثانویه در اثر برهمکنش‌های بین مولکولی و درون مولکولی ایجاد می‌شوند و یک یا هر دو پرایمر را از دسترس آنزیم پلیمراز خارج می‌کنند. این مسئله موجب کاهش چشم گیر میزان محصول خواهد شد .اولین ساختار ثانویه احتمالی که برای پرایمر طراحی شده ممکن است تشکیل شود دایمر (dimer) است. دایمر یعنی اینکه پرایمرها بصورت تکمیل کننده هم طراحی می­ شوند (شکل 1) و به هم می­ چسبند که این موضوع اصلا برای PCR مطلوب نیست.
تشکیل دایمرها کیفیت PCR را پایین می­ آورد. این مورد را نرم افزارهای مختلف بررسی می­کند و نرم افزار به شما میگوید که پرایمرهای طراحی شده دایمر تشکیل می­دهند یانه. اگر دو پرایمر forward و Reverse تشکیل دایمر دهند cross dimer نامیده می­شود.
این ساختارها در اثر برهم‌کنش بین دو پرایمر از یک نوع رخ می‌دهند. زمانی که دو پرایمر forward و یا دو پرایمر Reverseبه هم می چسبند self dimer ایجاد می­ شود. که self dimerهایی که در انتهای ′3 تشکیل می­شوند بسیار خطرناک هستند.

همان طور که می‌دانیم، فراوانی پرایمرها در مخلوط واکنش، ‌بسیار بیشتر از ژن هدف است. در این حالت، اگر مثلا پرایمر forward طوری طراحی شود که بخشی از توالی آن، مکمل بخش دیگر باشد، در مرحله annealing، به جای اتصال به مولکول الگو،‌ به پرایمر همتای دیگر متصل خواهد شد و آنزیم نیز، رشته جدیدی را از روی آن سنتز خواهد کرد. نتیجه این امر، خارج شدن پرایمر از دسترس الگو است که به ضعیف شدن باند محصول در ژل الکتروفورز منجر می‌شود. در عوض، باندهای کوتاهی در پایین ژل الکتروفورز دیده می‌شوند که در نتیجه یک تکثیر اشتباهی ایجاد شده‌اند.

شکل 1: پرایمر دایمر از نوع cross dimer یا self dimer

اگر یک پرایمر از انتهای ′3 یا ′5 روی خودش تا بخورد تشکیل hairpin می­ دهد (شکل 2).

شکل 2: تشکیل ساختار ساقه حلقه

عمدتا نرم افزارها پایداری ساختارهای ثانویه را با عدد ΔG نشان می­ دهند. این عدد بیانگر انرژی مورد نیاز برای شکستن آن ساختار است. هرچه ΔG منفی تر باشد ساختار پایدارتر است و باید از آن پرایمر صرف نظر کرد. ΔG بزرگتر از kcal/mol 5- عدد قابل قبول برای انواع دایمر است. برای قسمت وسط دایمرها مقدار ΔG باید بزرگتر kcal/mol 6- از باشد. عدد ΔG قابل قبول برای ساختار ثانویه Hairpin بزرگتر از kcal/mol 2- در انتهای پرایمر و kcal/mol 3- برای وسط پرایمر است.

2- توالی های تکراری (Repeats)

یکی از مواردی که در زمان طراحی پرایمر باید از آن اجتناب کرد این است که وقتی روی رشته الگو یک تکرار دیده می­شود از آن قسمت پرایمر طراحی نشود. این پارامتر نوکلئوتیدهای دوتایی تکراری را نشان می­دهد. مثلا روی رشته الگو 5′-GCATATATATATCGT-3′ را در نظر بگیرید. توالی AT چندبار تکرار شده است سعی شود از این بخش طراحی انجام نشود. توالی‌های تکراری،‌ احتمال تشکیل self-dimer را به شدت افزایش می‌دهند. یک پرایمر،‌ حداکثر مجاز به حمل 3 دی-نوکلئوتید تکراری است.

3- توالی های تکراری پشت سر هم (Run)

وقتی مشاهده می­شود که روی رشته الگو یک نوکلئوتید به تعداد زیادی تکرار شده است (بیشتر از 3 تا) نباید آن بخش را به عنوان پرایمر انتخاب کرد. به این تکرارهای پی در پی Run می­گویند. مثلا اگر سه تا G پشت سر هم تکرار شود G-Run نامیده می­شود. چنین تکرارهایی،‌ احتمال اتصال اشتباه پرایمر را افزایش می‌دهند.