مقدمه

نرم افزار Oligo 7 را می­توان به عنوان یک ابزار ضروری و لازم برای طراحی و تجزیه و تحلیل پرایمرهای PCR، ژن­های مصنوعی و انواع مختلف پروب­ ها (probe) از جمله siRNA و molecular beacons نام برد. الگوریتم ­های جستجو درOligo 7، بر مبنای جدیدترین اطلاعات است و پرایمرهای بهینه شامل Taqman, highly multiplexed, consensus یا پرایمرهای degenerate را برای PCR پیدا می ­کند. در این نرم افزار پردازش گروهی فایل­ ها امکان پذیر بوده و علاوه بر این می­توان از آن به عنوان ابزاری ارزشمند در تشخیص جهش ­های ژنتیکی استفاده نمود. هر پرایمر و یا جفت پرایمر، Oligo تجزیه و تحلیل ­های مختلف را به همراه اطلاعات مفیدی مانند DNA و ساختار ثانویه RNA، پرایمرهای نادرست، ترکیبات و خواص فیزیکی مفید و ... را نشان می دهد.

از ویژگی­ های این نرم افزار می­ توان به طراحی پرایمرها به صورت خودکار، امکان طراحی پرایمر به صورت دستی، بررسی تشکیل ساختارهای ثانویه و سنجاق سری (hairpin) در پرایمرها، تجزیه و تحلیل پرایمرهای PCR، طراحی و تجزیه و تحلیل انواع پروب­ ها، نمایش ترکیب ­های مفید هر پرایمر می­ توان اشاره کرد.

پیدا کردن توالی ژن

برای طراحی پرایمر با هر نرم افزاری ابتدا باید از مبانی و اصول طراحی پرایمر را آگاهی کامل داشت. این اصول برای طراحی پرایمر با همه نرم افزارها یکسان است. برای طراحی پرایمری که کارایی بالایی داشته باشد، دانستن اینکه پارامترهای طراحی پرایمر به چه دلیل استفاده می­ شوند و محدوده تغییر آنها چقدر است، بسیار لازم و ضروری است که در مورد آنها در قسمت مبانی تئوری طراحی پرایمر مفصل توضیح داده شد. برا ی پیدا کردن توالی ژن مورد نظر ابتدا وارد سایت ncbi شوید. در این سایت دیتابیس­ های مختلفی را می ­توانید استفاده کنید. طبق شکل 1، در قسمت شماره 1، nucleotide را انتخاب کرده و در قسمت 2 نام ژن مورد نظر را بنویسید (شکل 1).

فرض کنید ما قصد داریم توالی آنتی­ ژن سطحی هپاتیت B را پیدا کنیم. در قسمت شماره 2 نام این ژن را نوشته و inter را کلیک می­ کنیم (شکل 2).

در جستجوی توالی ژنی، تعداد زیادی توالی توسط ncbi به شما معرفی می­ شود. همان طور که مشاهده می­ کنید نتیجه این جستجو 56 توالی است. اگر نمی­ دانید که توالی ژنی شما دقیقا کدام است، بهتر است برای پیدا کردن توالی ژنی از شماره دسترسی (accession number) که در مقالات وجود دارد استفاده کرد. توالی مورد نظر ما، اولین توالی با شماره دسترسی AF065119.1 است که آن را انتخاب می­ کنیم.

در قسمت GenBank علاوه بر توالی، همه اطلاعات مربوط به ژن را می ­توانید ببینید (شکل 3). از این قسمت نمی­ توان توالی ژن را کپی کرد. با انتخاب FASTA می­توان توالی را با فرمت FASTA دریافت کرد (شکل 4) از این قسمت می­توان توالی ژن را کپی کرد.

وارد کردن توالی جدید به نرم افزار Oligo 7

برای این کار ابتدا وارد نرم افزار شوید. از قسمت File، گزینه New Sequence را انتخاب کنید. با فشار دادن همزمان Ctrl N نیز می ­توانید از این منو استفاده کنید (شکل 5). همچنین می­توانید با استفاده از گزینه New Database و با داشتن شماره دسترسی و اتصال به اینترنت توالی مورد نظر را از دیتابیس­های ncbi، Add gene و ... مستقیما به نرم افزار وارد کنید. گزینه Open، فایل­هایی را که با فرمت FASTA روی کامپیوتر خود ذخیره کرده اید را برای شما باز می­کند. گزینه Open recently، فایل­هایی را که اخیرا توسط نرم افزار باز شده به شما نشان می­دهد و این منو کار وارد کردن توالی را برای شما بسیار راحت می­کند.

شکل 5. توالی را از ncbi کپی کنید و در پنجره باز شده paste کنید. سپس روی accept کلیک کنید (شکل 6). توالی وارد نرم
افزار می­شود (شکل 7).

در قسمت بالا سمت چپ (قسمت شماره 1 که با کادر سبز رنگ در شکل 7 مشخص شده است) جدول مربوط به DNA sequence را مشاهده می­کنید. این قسمت مشخصات کلی توالی را نشان می­دهد. همانطور که در شکل 7 مشاهده می­کنید طول قطعه تکثیری nt681 است. Open reading frame را هم 1 نشان داده است. Current oligo length هم طول توالی که با رنگ خاکستری در قسمت 4 مربوط به شکل 7 مشاهد می­شود را نشان می ­دهد که nt 22 است. البته این طول قابل تغییر است که در ادامه اینکار انجام خواهد شد. و در انتها هم موقعیت توالی خاکستری را نشان می ­دهد. پوزیشنی که نشان می­دهد اولین موقعیت از سمت چپ توالی خاکستری رنگ است. Tm این توالی را هم مشخص می­کند.

پنجره دوم با کادر قرمز در شکل 7 نشان داده شده است. این پنجره selection نام دارد. هر توالی را که بخواهید به عنوان اولیگو یا پرایمر انتخاب کنید، اینجا انتخاب می­شود و با کلیک روی دکمه forward و سبز رنگ شدن دکمه، آن توالی به عنوان پرایمر forward در نرم افزار انتخاب می­شود.
وقتی پرایمرهای forward و reverse مشخص شد گزینه product برای شما فعال خواهد شد. اگر روی آیکونی که وسط آن i دارد کلیک کنید اطلاعاتی در مورد PCR و محصول آن به شما ارائه خواهد داد.

در پنجره سوم که در شکل 7 با کادر آبی نشان داده شده، می­توان بخش­های مختلفی از قطعه DNAایی که وارد نرم افزار شده است را مشخص کنید. به صورت default این نرم افزار کل قطعه را در نظر می­گیرد. ولی شما در این بخش می­توانید یک قطعه مشخص را برای نرم افزار تعیین کنید که تنها از این بخش پرایمر طراحی شود. یا مثلا زمانی­که می­خواهید نرم افزار برای شما پرایمر سرچ کند، می­توانید به نرم افزار دستور دهید که پرایمرها را از توالی nt 200- 500 طراحی کند.

در زیر این قسمت یک گراف دیده می­شود که melting temperature graph نامیده می­شود. این گراف به همراه خط­هایی که زیر آن مشاهده می­کنید zoon out area نامیده می­شود. بخش پایین (قسمت 4) که با کادر نارنجی نشان داده شده zoom in area نامیده می­شود. در قسمت zoon out area یک نمای کلی از توالی را در نرم افزار مشاهده می­کنید. همانطور که در گراف دیده می­شود در بعضی قسمت­ها Tm بالاتر و در بعضی قسمت­ها پایین­تر است و این نمای کلی به شما کمک می­کند که بهتر بتوانید از قسمت­های مختلف را برای طراحی پرایمر انتخاب کنید. قسمتی که در گراف زرد رنگ شده است را در قسمت zoom in area می­توانید مشاهده کنید.

خط­های موازی که زیر zoon out area مشاهده می­کنید (شکل 8) هر کدام بیانگر نکته مهمی هستند. مستطیل اول از 5 خط تشکیل شده است. خط اول محلی را که پرایمر forward از آن طراحی شده است را با رنگ آبی نشان می­دهد. خط دوم محل طراحی upper oligo را نشان می­دهدو خط سوم محصول PCR را با رنگ خاکستری نشان می­دهد و خط چهارم بیانگر محل lower oligo است و خط پنجم هم نشانگر محل پرایمر reverse است که با رنگ آبی نمایش داده می­شود.

مستطیل دوم دارای 4 خط است. خط اول نشان دهنده loopهای خیلی قوی است که با رنگ زرشکی نشان داده می­شود و این نواحی برای طراحی پرایمر اصلا مناسب نیستند. خط دوم که تعداد زیادی بخش قرمز دارد loopهای ضعیف را نشان می­دهد. می­توان از این قسمت­ها پرایمر طراحی کرد ولی حتما باید مشخصات پرایمر بررسی شود که این loopها در دمای بالا قابلیت تشکیل نداشته باشند و این قسمت­ها در حین PCR باز می­شوند. خط سوم نواحی پالیندروم را نشان می­دهد که با رنگ سبز دیده می­شوند این نواحی هم برای طراحی مناسب نیستند. در خط چهارم اگر دنبال ناحیه خاصی روی توالی باشید نتیجه را به صورت کلی روی این خط نشان می­دهد.

مستطیل سوم که تنها یک خط دارد هر بخشی از توالی را که در قسمت 3 انتخاب کردید برای شما نشان می­دهد. تا زمانی که پرایمرها و الیگوها مشخص نشوند، این بخش­ها سفید رنگ خواهند بود.

مشخص کردن یک بخش خاص از توالی

شما می­توانید یک قطعه مشخص را برای نرم افزار تعیین کنید و از نرم افزار بخواهید تنها از این بخش پرایمر طراحی شود. یا مثلا زمانی­که می­خواهید نرم افزار برای شما پرایمر سرچ کند، می­توانید به نرم افزار دستور دهید که پرایمرها را از توالی nt 200- 500 طراحی کند. برای این کار ابتدا وارد منوی Edit شده و روی feature کلیک کنید. سپس روی در پایین سمت چپ کلیک کنید تا یک بخش جدید برای شما ایجاد کند. سپس نام توالی را بنویسید و محدوده توالی را بصورت 100..400 تعیین کنید. اگر بخواهید روی یک بخش توالی دو قسمت مشخص کنید از دستور join استفاده کنید. این دستور Join(115..160,280..340) است. در نهایت روی accept کلیک کنید تا تغییرات اعمال شود (شکل 9). همانطور که در شکل مشاهده می­کنید نرم افزار از نوکلیوتید 115 تا 160 و همچنین از 280 تا 340 توالی را با رنگ بنفش برای شما مشخص کرده است. اکنون می­توانید این پنجره را ببندید.

نکته قابل ذکر این است که بعد طراحی پرایمر و سفارش سنتز آن، برای اینکه بهترین دمای تکثیر پرایمر تعیین شود باید از تکنیک Gradient PCR استفاده کرد. شرکت دنا ژن تجهیز هر دو حالت PCR معمولی و گرادیان PCR را طراحی و تولید نموده و جهت فروش آن را به بازار عرضه می­کند.

آموزش نرم افزار اولیگو 7(قسمت دوم)