طراحی پرایمر به صورت دستی

فرض کنید می­خواهیم پرایمری طراحی کنیم که طول آن nt 20 و mT آن حدود 52 یا 53 باشد. برای تعیین طول پرایمر وارد منوی Change شده و روی Current oligo length کلیک کنید و طول پرایمر را 20 انتخاب کرده و سپس Ok کنید. برای پیدا کردن پرایمری با Tm مورد نظر با استفاده از arrow key پرایمر را به چپ یا راست حرکت دهید و طبق انچه در شکل 10 مشاهده می­کنید Tm را چک کنید.

نکته مهم این است که بعد از هر بار تغییر مکان پرایمر باید روی forward primer کلیک شود تا mTپرایمر در مکان جدید نمایش داده شود. برای پرایمر reverse هم دقیقا همین مراحل انجام می­شود. برای بررسی پرایمرهای انتخاب شده ابتدا وارد منو Analyze شده و گزینه PCR را انتخاب کنید (شکل 11). در این پنجره یک اطلاعات کلی در مورد PCR نشان داده می­شود. اگر نکته­ ای وجود داشته باشد که شرایط مناسب برای انجام PCR نداشته باشد با رنگ قرمز اخطار می­دهد. حتما به این هشدارها توجه شود و اشکالات پرایمر بر طرف شود. در اینجا مشکل پرایمر طراحی شده این است که اختلاف بین mTپرایمر و محصول زیاد است. این اختلاف دما نباید از 25 بیشتر باشد. بنابر این بهتر است از نقاطی که درصد GC بیشتری دارند پرایمر طراحی شود و یا اینکه طول پرایمر بیشتر شود (مثلا nt
22). جای پرایمر را تغییر دهید تا به پرایمر مطلوب برسید تا زمانیکه نرم افزار هیچ هشداری نداشته باشد.

1- بررسی Duplex primer

یک نکته بسیار مهم برای طراحی پرایمر بررسی این موضوع است که پرایمر forward و reverse مکمل هم نباشند و به اصطلاح duplex تشکیل ندهند (شکل 12). نتیجه این امر خارج شدن پرایمر از دسترس الگو است که به ضعیف شدن باند محصول در ژل الکتروفورز منجر می‌شود. در عوض، باندهای کوتاهی در پایین ژل الکتروفورز دیده می‌شوند که در نتیجه یک تکثیر اشتباهی ایجاد شده‌اند. برای بررسی این موضوع مهم وارد منوی Analyze شده و سپس روی Duplex formation کلیک کرده و پرایمر forward را بررسی می­کنیم. و سپس همین کار را برای پرایمر reverse انجام می­دهیم. همانطور که در شکل 12 مشاهده می­کنید پرایمر forward و reverse انتها های مکمل هم دارند که بسیار نامطلوب است و باعث در گیر شده آنزیم پلیمراز می­شود و کارایی پرایمر پایین می­ آید. اطلاعاتی در این پنجره دیده می­شود که باید به آنها توجه کرد، باندهای تشکیل شده است که تعداد این باندها نباید از 5 تا بیشتر شود. و نکته دیگر مقدار ΔGاست. هرچه ΔG منفی­ تر باشد ساختار پایدارتر است و باید از آن پرایمر صرف نظر کرد. ΔG بزرگتر از kcal/mol 5- عدد قابل قبول برای انواع دایمر است.

مشخصات فنی و ثبت سفارش ریل تایم

2- بررسی ساختار ثانویه (Hairpin formation)

پرایمرهای طراحی شده نباید hairpin تشکیل دهند. اگر یک پرایمر از انتهای ′3 یا ′5 روی خودش تا بخورد تشکیل hairpin می­دهد. برای بررسی این موضوع وارد منوی Analyze شده و سپس روی Hairpin formation کلیک کرده و پرایمر forward را بررسی می­کنیم. و سپس همین کار را برای پرایمر reverse انجام می­ دهیم (شکل 13). در اینجا نیز تعداد باندهای هیدروژنی تشکیل شده نباید از 5 تا بیشتر شود. و نکته دیگر مقدار ΔGاست. هرچه ΔG منفی­ تر باشد ساختار پایدارتر است و باید از آن پرایمر صرف نظر کرد. ΔG بزرگتر از kcal/mol 5- عدد قابل قبول برای انواع دایمر است. ساختاری که در شکل 13 مشاهده می­شود در دمای 3/4 باز می­شود. بنابراین این ساختار در PCR مشکلی ایجاد نخواهد کرد.

3- بررسی اختصاصی بودن پرایمرها

این نرم افزار این قابلیت را دارد که مکان­ هایی که پرایمر به صورت غیراختصاصی متصل می­ شود را بررسی کند. برای بررسی این موضوع وارد منوی Analyze شده و سپس روی False Priming Site کلیک کرده و پرایمر forward را بررسی می­کنیم. سپس همین کار را برای پرایمر reverse انجام می­دهیم (شکل 14). در شکل 14 پرایمر به سه مکان متصل می ­شود. ولی باید بررسی شود که این مکان­ ها خطرناک هستند یا خیر. پرایمری که همه نوکلئوتیدهای آن با رشته مقابل پیوند ایجاد کرده همان نقطه­ ایی است که ما پرایمر را برای آن طراحی کردیم و طبق آنچه در شکل مشاهده می ­کنید میزان priming efficiency برابر 432 است که این مقدار نسبت به بقیه حالت­ ها از همه بیشتر است و این امتیاز، ایده آل­ ترین حالت را نشان می­دهد. این نرم افزار رشته sense را با رنگ آبی و رشته Antisense را با رنگ قرمز نشان می­دهد. بر اساس تجربه اگر ایده آل­ترین مقدار (برای این پرایمر 432 است) تقسیم بر 5 شود، آنهایی خطرناک هستند که بیشتر از یک پنجم این مقدار ایده آل، امتیاز بدست آورند. پس اگر در طراحی خود پرایمرهایی با جایگاه اشتباه و امتیاز بالا داشتید باید آن پرایمر را اصلاح کنید.

اگر به این پارامتر دقت نوشد ممکن است بعد از انجام PCR، روی ژل الکتروفورز آگارز باندهای غیر اختصاص ی با اندازه متفاوت مشاهده شود.

طراحی پرایمر به صورت اتوماتیک

می­خواهیم به نرم افزار دستور دهیم برای کل توالی پرایمر طراحی کند. برای این کار ابتدا وارد منوی search شده و سپس گزینه for primers probes انتخاب کنید (شکل 15).

مشخصات فنی و ثبت سفارش میکروفیوژ ورتکس

پنجره­ ایی باز می­شود (شکل 16) که تنظیمات پرایمر را اینجا تعیین می­شود. در قسمت search options تعیین می­شود که پرایمر برای PCR طراحی شود. اگر بخواهید برای Real time PCR پرایمر طراحی کنید گزینه TaqMan Probes PCR Pairs را انتخاب کنید. در بخش سوم هم می­توانید با توجه به هدفی که دارید انواع PCR را انتخاب کنید. در قسمت Subsearch می­توانید مشخصاتی که پرایمر شما باید داشته باشه را به نرم افزار معرفی کنید. در مورد این مشخصات در فایل مبانی تئوری طراحی پرایمر به تفصیل ارائه گردید. معمولا تنظیمات بخش Subsearchرا تغییر نمی­ دهند زیرا در بهترین حالت بهینه به صورت default قرار گرفته است.

منوی انتخاب کنید و روی Parameters کلیک کنید. در اینجا می­توانید مشخصات PCR را تعیین کنید (شکل 17). چون نرم افزار برای تعیین دمای mTاز فرمول Nearest Neighbor استفاده می­کند تغییر شرایط ازمایش می­تواند در mTپرایمر تغییر ایجاد کند. بنابراین شرایطی را که در ازمایشگاه در آن PCR انجام می­دهید را وارد کنید.

در منوی Constraints (شکل 18) می­توانید محدودیت­ها را برای پرایمر تعیین کنید. این محدودیت­ها مفصل در فایل مبانی تئوری طراحی پرایمر بحث شد. گزینه اول می­توانید طول پرایمر را تعیین کنید. و مقادیر بهینه را بر اساس شرایط آزمایش و آنچه قبلا در فایل مبانی تئوری طراحی پرایمر آورده شده انتخاب کنید.

در منوی More constraints می­توانید مشخصات اختصاصی­تری برای پرایمر خود به نرم افزار بدهید (شکل 19).

به منوی sequence Constraints (شکل 20) را تغییر ندهید. این منو برای کسانی است که می­خواهند پرایمرشان توالی خاصی را دنبال کند. مثلا کسانی که کار کلونینگ انجام می­دهند اگر بخواهند جایگاه برش آنزیمی روی پرایمرشان باشد از این منو استفاده می­کنند.

در قسمت Scores سیستم امتیاز دهی را نشان می­دهد که نیازی به هیچ گونه تغییرات ندارد (شکل 21).

بعد از تنظیمات قسمت Parameters به قسمت Ranges در شکل 16 وارد شوید. در این قسمت محدوده­ایی که پرایمر forward روی رشته sense قرار می­گیرد را تعیین می­کنید و همچنین محدوده پرایمر reverse را که روی رشته منفی یا Anti-sense قرار دارد مشخص می­شود. طول محصول PCR را هم می­توانید تعیین کنید (شکل 22). اگر تیک گزینهfind products in check region(s) only را فعال کنید دیگر نیازی به تعیین محدوده برای پرایمر نیست. بخش­های دیگر نیز نیاز به تغییر ندارند. Ok کنید و روی گزینه search کلیک کنید.

یک لیست از پرایمرهای پیشنهاد شده را برای شما تعیین می­کند (شکل 23). که مشخصاتی مثل GC% و طول محصول و دمای Ta را برای شما مشخص می­کند

اگر روی هر کدام دو بار کلیک کنید مشخصات PCR را به شما نشان می­دهد (شکل 24).

نکته قابل ذکر این است که بعد طراحی پرایمر و سفارش سنتز آن، برای اینکه بهترین دمای تکثیر پرایمر تعیین شود باید از تکنیک Gradient PCR استفاده کرد. شرکت دنا ژن تجهیز هر دو حالت PCR معمولی و گرادیان PCR را طراحی و تولید نموده و جهت فروش آن را به بازار عرضه می­کند.