وبلاگ دنا ژن تجهـیز
ادامه آموزش نرم افزار اولیگو(قسمت دوم)
ترموسایکلر ایرانی - دستگاه PCR ساخت ایران - خرید PCR ایرانی - تکنیک PCR - دستگاه ریل تایم - ریل تایم ترموسایکلر - ریل تایم PCR - گرادیان ترموسایکلر - گرادیان PCR - دستگاه گرادیان ترموسایکلر -.webp)
طراحی پرایمر به صورت دستی
فرض کنید میخواهیم پرایمری طراحی کنیم که طول آن nt 20 و mT آن حدود 52 یا 53 باشد. برای تعیین طول پرایمر وارد منوی Change شده و روی Current oligo length کلیک کنید و طول پرایمر را 20 انتخاب کرده و سپس Ok کنید. برای پیدا کردن پرایمری با Tm مورد نظر با استفاده از arrow key پرایمر را به چپ یا راست حرکت دهید و طبق انچه در شکل 10 مشاهده میکنید Tm را چک کنید.
نکته مهم این است که بعد از هر بار تغییر مکان پرایمر باید روی forward primer کلیک شود تا mTپرایمر در مکان جدید نمایش داده شود. برای پرایمر reverse هم دقیقا همین مراحل انجام میشود. برای بررسی پرایمرهای انتخاب شده ابتدا وارد منو Analyze شده و گزینه PCR را انتخاب کنید (شکل 11). در این پنجره یک اطلاعات کلی در مورد PCR نشان داده میشود. اگر نکته ای وجود داشته باشد که شرایط مناسب برای انجام PCR نداشته باشد با رنگ قرمز اخطار میدهد. حتما به این هشدارها توجه شود و اشکالات پرایمر بر طرف شود. در اینجا مشکل پرایمر طراحی شده این است که اختلاف بین mTپرایمر و محصول زیاد است. این اختلاف دما نباید از 25 بیشتر باشد. بنابر این بهتر است از نقاطی که درصد GC بیشتری دارند پرایمر طراحی شود و یا اینکه طول پرایمر بیشتر شود (مثلا nt
22). جای پرایمر را تغییر دهید تا به پرایمر مطلوب برسید تا زمانیکه نرم افزار هیچ هشداری نداشته باشد.
1- بررسی Duplex primer
یک نکته بسیار مهم برای طراحی پرایمر بررسی این موضوع است که پرایمر forward و reverse مکمل هم نباشند و به اصطلاح duplex تشکیل ندهند (شکل 12). نتیجه این امر خارج شدن پرایمر از دسترس الگو است که به ضعیف شدن باند محصول در ژل الکتروفورز منجر میشود. در عوض، باندهای کوتاهی در پایین ژل الکتروفورز دیده میشوند که در نتیجه یک تکثیر اشتباهی ایجاد شدهاند. برای بررسی این موضوع مهم وارد منوی Analyze شده و سپس روی Duplex formation کلیک کرده و پرایمر forward را بررسی میکنیم. و سپس همین کار را برای پرایمر reverse انجام میدهیم. همانطور که در شکل 12 مشاهده میکنید پرایمر forward و reverse انتها های مکمل هم دارند که بسیار نامطلوب است و باعث در گیر شده آنزیم پلیمراز میشود و کارایی پرایمر پایین می آید. اطلاعاتی در این پنجره دیده میشود که باید به آنها توجه کرد، باندهای تشکیل شده است که تعداد این باندها نباید از 5 تا بیشتر شود. و نکته دیگر مقدار ΔGاست. هرچه ΔG منفی تر باشد ساختار پایدارتر است و باید از آن پرایمر صرف نظر کرد. ΔG بزرگتر از kcal/mol 5- عدد قابل قبول برای انواع دایمر است.
مشخصات فنی و ثبت سفارش ریل تایم
2- بررسی ساختار ثانویه (Hairpin formation)
پرایمرهای طراحی شده نباید hairpin تشکیل دهند. اگر یک پرایمر از انتهای ′3 یا ′5 روی خودش تا بخورد تشکیل hairpin میدهد. برای بررسی این موضوع وارد منوی Analyze شده و سپس روی Hairpin formation کلیک کرده و پرایمر forward را بررسی میکنیم. و سپس همین کار را برای پرایمر reverse انجام می دهیم (شکل 13). در اینجا نیز تعداد باندهای هیدروژنی تشکیل شده نباید از 5 تا بیشتر شود. و نکته دیگر مقدار ΔGاست. هرچه ΔG منفی تر باشد ساختار پایدارتر است و باید از آن پرایمر صرف نظر کرد. ΔG بزرگتر از kcal/mol 5- عدد قابل قبول برای انواع دایمر است. ساختاری که در شکل 13 مشاهده میشود در دمای 3/4 باز میشود. بنابراین این ساختار در PCR مشکلی ایجاد نخواهد کرد.
3- بررسی اختصاصی بودن پرایمرها
این نرم افزار این قابلیت را دارد که مکان هایی که پرایمر به صورت غیراختصاصی متصل می شود را بررسی کند. برای بررسی این موضوع وارد منوی Analyze شده و سپس روی False Priming Site کلیک کرده و پرایمر forward را بررسی میکنیم. سپس همین کار را برای پرایمر reverse انجام میدهیم (شکل 14). در شکل 14 پرایمر به سه مکان متصل می شود. ولی باید بررسی شود که این مکان ها خطرناک هستند یا خیر. پرایمری که همه نوکلئوتیدهای آن با رشته مقابل پیوند ایجاد کرده همان نقطه ایی است که ما پرایمر را برای آن طراحی کردیم و طبق آنچه در شکل مشاهده می کنید میزان priming efficiency برابر 432 است که این مقدار نسبت به بقیه حالت ها از همه بیشتر است و این امتیاز، ایده آل ترین حالت را نشان میدهد. این نرم افزار رشته sense را با رنگ آبی و رشته Antisense را با رنگ قرمز نشان میدهد. بر اساس تجربه اگر ایده آلترین مقدار (برای این پرایمر 432 است) تقسیم بر 5 شود، آنهایی خطرناک هستند که بیشتر از یک پنجم این مقدار ایده آل، امتیاز بدست آورند. پس اگر در طراحی خود پرایمرهایی با جایگاه اشتباه و امتیاز بالا داشتید باید آن پرایمر را اصلاح کنید.
اگر به این پارامتر دقت نوشد ممکن است بعد از انجام PCR، روی ژل الکتروفورز آگارز باندهای غیر اختصاص ی با اندازه متفاوت مشاهده شود.
طراحی پرایمر به صورت اتوماتیک
میخواهیم به نرم افزار دستور دهیم برای کل توالی پرایمر طراحی کند. برای این کار ابتدا وارد منوی search شده و سپس گزینه for primers probes انتخاب کنید (شکل 15).
مشخصات فنی و ثبت سفارش میکروفیوژ ورتکس
پنجره ایی باز میشود (شکل 16) که تنظیمات پرایمر را اینجا تعیین میشود. در قسمت search options تعیین میشود که پرایمر برای PCR طراحی شود. اگر بخواهید برای Real time PCR پرایمر طراحی کنید گزینه TaqMan Probes PCR Pairs را انتخاب کنید. در بخش سوم هم میتوانید با توجه به هدفی که دارید انواع PCR را انتخاب کنید. در قسمت Subsearch میتوانید مشخصاتی که پرایمر شما باید داشته باشه را به نرم افزار معرفی کنید. در مورد این مشخصات در فایل مبانی تئوری طراحی پرایمر به تفصیل ارائه گردید. معمولا تنظیمات بخش Subsearchرا تغییر نمی دهند زیرا در بهترین حالت بهینه به صورت default قرار گرفته است.
منوی انتخاب کنید و روی Parameters کلیک کنید. در اینجا میتوانید مشخصات PCR را تعیین کنید (شکل 17). چون نرم افزار برای تعیین دمای mTاز فرمول Nearest Neighbor استفاده میکند تغییر شرایط ازمایش میتواند در mTپرایمر تغییر ایجاد کند. بنابراین شرایطی را که در ازمایشگاه در آن PCR انجام میدهید را وارد کنید.
در منوی Constraints (شکل 18) میتوانید محدودیتها را برای پرایمر تعیین کنید. این محدودیتها مفصل در فایل مبانی تئوری طراحی پرایمر بحث شد. گزینه اول میتوانید طول پرایمر را تعیین کنید. و مقادیر بهینه را بر اساس شرایط آزمایش و آنچه قبلا در فایل مبانی تئوری طراحی پرایمر آورده شده انتخاب کنید.
در منوی More constraints میتوانید مشخصات اختصاصیتری برای پرایمر خود به نرم افزار بدهید (شکل 19).
به منوی sequence Constraints (شکل 20) را تغییر ندهید. این منو برای کسانی است که میخواهند پرایمرشان توالی خاصی را دنبال کند. مثلا کسانی که کار کلونینگ انجام میدهند اگر بخواهند جایگاه برش آنزیمی روی پرایمرشان باشد از این منو استفاده میکنند.
در قسمت Scores سیستم امتیاز دهی را نشان میدهد که نیازی به هیچ گونه تغییرات ندارد (شکل 21).
بعد از تنظیمات قسمت Parameters به قسمت Ranges در شکل 16 وارد شوید. در این قسمت محدودهایی که پرایمر forward روی رشته sense قرار میگیرد را تعیین میکنید و همچنین محدوده پرایمر reverse را که روی رشته منفی یا Anti-sense قرار دارد مشخص میشود. طول محصول PCR را هم میتوانید تعیین کنید (شکل 22). اگر تیک گزینهfind products in check region(s) only را فعال کنید دیگر نیازی به تعیین محدوده برای پرایمر نیست. بخشهای دیگر نیز نیاز به تغییر ندارند. Ok کنید و روی گزینه search کلیک کنید.
یک لیست از پرایمرهای پیشنهاد شده را برای شما تعیین میکند (شکل 23). که مشخصاتی مثل GC% و طول محصول و دمای Ta را برای شما مشخص میکند
اگر روی هر کدام دو بار کلیک کنید مشخصات PCR را به شما نشان میدهد (شکل 24).
نکته قابل ذکر این است که بعد طراحی پرایمر و سفارش سنتز آن، برای اینکه بهترین دمای تکثیر پرایمر تعیین شود باید از تکنیک Gradient PCR استفاده کرد. شرکت دنا ژن تجهیز هر دو حالت PCR معمولی و گرادیان PCR را طراحی و تولید نموده و جهت فروش آن را به بازار عرضه میکند.