وبلاگ دنا ژن تجهـیز

تکنیک بلاتینگ قسمت اول

جداسازی و تشخیص پروتئین -

در این تکنیک باندهای پروتئینی از ژل به غشایی ماننده نیتروسلولز که قابلیت اتصال و تثبیت پروتئین ­ها را دارد، منتقل می ­شوند. در عمل بلاتینگ مولکول­ های پروتئین از زمینه ژل خارج می ­شوند و در سطح غشا در همان موقعیت قرار می­ گیرند. از این رو به سادگی و با مقدار کمتری از مواد می ­توان به مطالعه آنها پرداخت، یا آنها را جدا نمود و مورد استفاده قرار داد. به منظور تشخیص پروتئین­ ها یا آنزیم­ های منتقل شده به غشا می­ توان از لیگاندهای اختصاصی یا سوبستراهای مربوطه استفاده کرد. آنتی­ بادی­ ها از
متداول ­ترین موادی هستند که برای تشخیص اختصاصی پروتئین­ ها در غشا بکار می­ روند.
از همین رو چنین روش­هایی به ایمونوبلاتینگ معروفند.

undefined

روش­های انتقال پروتئین

دراغلب موارد انتقال پروتئین از ژل به غشا با کمک نیروی الکتریکی صورت می­گیرد. این نوع انتقال به انتقال الکتروفورزی معروف است. انتقال الکتروفورزی به دو صورت انجام می ­شود: انتقال در تانک که به انتقال تر معروف است و انتقال به روش نیمه خشک

undefined

البته می توان به طریق انتشار با خاصیت مویینگی یا پمپ خلا نیز پروتئین ها را انتقال داد.

روش انتقال در تانک (انتقال تر) شکل اولیه انتقال الکتروفورزی است.انتقال پروتئین ها در این روش در یک تانک پر از بافر که الکترودها در دو طرف آن قرار دارند، انجام می گیرد. روش دوم که به روش نیمه خشک است در سال های اخیر مقبولیت بیشتری پیدا کرده است. انتقال پروتئین ها در این روش، در بین دو الکترود که به شکل صفحه هستند، صورت می گیرد. روش نیمه خشک ساده تر و سریع تر است و در سیستم بافری پیوسته یا ناپیوسته قابل انجام است.

انتقال پروتئین ها از ژل به غشا از طریق انتشار، خاصیت مویینگی، یا با کمک پمپ خلا نیز امکان پذیر است. در انتقال به روش انتشار یک یا دو غشا؛ در یک یا دو طرف ژل قرار می دهند. در این حالت پروتئین ها از طریق انتشار از ژل به غشا انتقال می یابند. با افزایش درجه حرارت می توان انتشار را تسریع نمود. انتقال با خاصیت مویینگی معمولا برای انتقال DNA و در بعضی موارد برای انتقال پروتئین ها کاربرد دارد. در این روش غشا را روی ژل می گذارند و در هر طرف آن چند لایه کاغذ صافی قرار می دهند. ارتباط کاغذ صافی زیر ژل با بافر موجب حرکت مایع به طرف لایه های کاغذ بالا می شود و به این ترتیب پروتئین ها از ژل به غشا منتقل می شوند. روش انتقال با کمک خلا سریع تر و دقیق تر از روش های انتقال از طریق انتشار و خاصیت مویینگی است. برای انتقال پروتئین ها در این روش معمولا از پمپ خلا با فشار ضعیف استفاده می شود. از بین تمامی روش های ذکر شده روش انتقال نیمه خشک از دیگر روش ها ساده تر و دقیق تر بوده و مقبولیت بیشتری در بین محقیقن دارد.

undefined

خرید وسترن بلات

غشاهای مورد استفاده در بلاتینگ

در عمل بلاتینگ معمولا از غشاهای نیتروسلولزی و یا پلی وینیلیدن دی­فلورید (PVDF) استفاده می­ کنند. این دو غشا ظرفیت خوبی
در اتصال به پروتئین ­ها دارند. نیتروسلولز ارزان­ تر است ولی ظرفیت مکانیکی کمی دارد و شکننده می­ باشد. اندازه منافذ نیتروسلولز بین 05/0 تا 45/0 میکرون متغیر می ­باشند. هرچه اندازه منافذ یک غشا کوچک ­تر باشد سطح مخصوص و ظرفیت اتصال آن بیشتر خواهد بود. دی آزو بنزیل اکسی متیل (DBM) ، دی آزو فنیل تیواتر (DPT) و نایلون از دیگر غشاهایی هستند که در موارد خاصی از عمل بلاتینگ بکار می ­روند. غشاهای نایلونی از ظرفیت و توان مکانیکی بالایی برخوردارند، اما بر خلاف سایر غشاها بار مثبت دارند. از این رو اغلب رنگ ­های آنیونی که برای پروتئین مورد استفاده قرار می­ گیرند، به آنها متصل می­ شوند. در مواردی که جداسازی پروتئین خاصی از غشا مورد نظر باشد، استفاده از غشاهای تعویض یون برای بلاتینگ مناسب می­ باشد. برای این کار قسمتی از غشا که حاوی پروتئین مورد نظر است، جدا می ­شود. سپس با قرار دادن قسمت جدا شده در بافر با PH یا قدرت یونی متفاوت، پروتئین آزاد می ­شود.

روش انتقال در تانک

روش انتقال در تانک شکل پای ه­ای انتقال به کمک الکتروفورز می­ باشد. بدین لحاظ غالبا این روش را معادل الکتروبلاتینگ می­دانند. تصویر کلی این روش در شکل زیر آمده است.

undefined

شکل 4. شماتیک کلی روش انتقال تر در تانک وسترن بلات. کاست ژل و غشا را کنار
هم نگه می­ دارد. کاغذ­های صافیو پدهای آنها در دو طرف ژل به صورت کامل با ژل تماس
دارند. نهایتا کاست ژل به صورت عمودی در تانک قرار می ­گیرد.

معمولا انتقال در تانک در بافر تریس-گلیسین انجام می­ گیرد. این بافر برای جداسازی انواعی از پروتئین ­ها که به روش SDS-PAGE
جداشده ­اند مناسب است. وجود متانول در این بافر برای جلوگیری از تورم ژل، جداسازی SDS از پروتئین ها و بالا بردن ظرفیت
اتصال به غشا است. اما، متانول بخصوص در غلظت ­های بالا از عوامل بازدارنده انتقال پروتئین ها محسوب می ­شود. در بعضی موراد به منظور افزایش حلالیت پروتئین­ ها مقداری دترجنت (به عنوان مثال SDS با غلظت 02/0 درصد) به این بافر می­ افزایند. به هر حال باید توجه داشت که دترجنت­ ها به خصوص در غلظت ­های بالا از اتصال پروتئین­ ها به غشا جلوگیری می­ نمایند.